Restrikciós enzimek funkciói, hatásmechanizmusa, típusai és példái



az restrikciós enzimek az egyes archaea és baktériumok által használt endonukleázok gátolják vagy "korlátozzák" a vírusok terjedését. Ezek különösen gyakoriak a baktériumokban, és védelmi rendszerük részét képezik az idegen DNS-nek, a restrikciós / módosítási rendszernek.

Ezek az enzimek a kettős szálú DNS vágását specifikus helyeken katalizálják, reprodukálhatóan és további energia nélkül. A legtöbb esetben kofaktorok, mint például magnézium vagy más kétértékű kationok jelenléte szükséges, bár egyesek ATP-t vagy S-adenozil-metionint is igényelnek..

A restrikciós endonukleázokat 1978-ban Daniel Nathans, Arber Werner és Hamilton Smith fedezte fel, akik megkapták a Nobel-díjat a gyógyításért. A neve általában a szervezetből származik, ahol először megfigyelték őket.

Az ilyen enzimeket széles körben alkalmazzák a DNS-klónozási módszerek és más molekuláris biológia és a géntechnológiai stratégiák kifejlesztésében. A specifikus szekvenciák felismerésének jellemzői és a felismerési helyekhez közeli szekvenciák vágására való képessége erőteljes eszközt jelent a genetikai kísérletekben.

A restrikciós enzimek által létrehozott fragmensek, amelyek egy adott DNS-molekulára hatottak, felhasználhatók az eredeti molekula "térképének" újbóli létrehozására azáltal, hogy információt szolgáltatnak azokról a helyekről, ahol az enzim a DNS-t vágja le.

Néhány restrikciós enzim azonos DNS-felismerési helyet tartalmazhat, de nem feltétlenül vágja le ugyanúgy. Tehát vannak olyan enzimek, amelyek a tompa végeket és az elhagyó kohéziós végeket kivágó enzimeket elvágják, amelyek különböző molekuláris biológiai alkalmazásokat tartalmaznak.

Jelenleg több, különböző kereskedelmi forgalomban kapható kereskedelmi forgalomban kapható, kereskedelmi forgalomban kapható restrikciós enzim létezik; ezek az enzimek "egyéni" molekuláris ollóként működnek különböző célokra.

index

  • 1 Funkciók
  • 2 Működési mechanizmus
  • 3 típus
    • 3.1. I. típusú restrikciós enzimek
    • 3.2 II. Típusú restrikciós enzimek
    • 3.3. III. Típusú restrikciós enzimek
    • 3.4 IV. Típusú restrikciós enzimek
    • 3.5 V típusú restrikciós enzimek
  • 4 Példák
  • 5 Referenciák

funkciók

A restrikciós enzimek a polimerázok ellentétes funkcióját szolgálják, mivel a nukleotidláncban a szomszédos nukleotidok között a foszfodiészter kötésben lévő észterkötést hidrolizálják vagy megszakítják.

A molekuláris biológiában és a géntechnológiában széles körben használják az expressziós és klónozó vektorok, valamint a specifikus szekvenciák azonosítására szolgáló eszközöket. Alkalmasak rekombináns genomok előállítására és nagy biotechnológiai potenciállal rendelkeznek.

A génterápiában a közelmúltban elért eredmények a restrikciós enzimek jelenlegi alkalmazását teszik lehetővé bizonyos géneknek olyan vektorokba történő bevitelére, amelyek az ilyen gének élő sejtekbe történő szállítására szolgálnak, és amelyek valószínűleg képesek a sejt genomba történő bejuttatásához. állandó változások.

Működési mechanizmus

A restrikciós enzimek katalizálhatják a kettős szálú DNS vágását, bár egyesek képesek felismerni az egyszálú DNS szekvenciákat és még az RNS-t is. A vágás a szekvenciák felismerése után következik be.

A hatásmechanizmus a foszfodiészter-kötés egy foszfátcsoport és egy dezoxiribóz közötti hidrolízise a DNS minden szálának gerincében. Az enzimek közül sokan képesek ugyanabba a helyre vágni, amit felismernek, míg mások 5 és 9 pár bázis között vágnak le, vagy utána..

Általában ezek az enzimek a foszfátcsoport 5'-végénél vágódnak, és 5 'foszforil-véggel és 3-as terminális hidroxil-véggel DNS-fragmenseket kapnak..

Mivel a fehérjék nem érintkeznek közvetlenül a DNS felismerési helyével, azokat egymást követően át kell helyezni, amíg el nem érik az adott helyet, talán a DNS-szál "csúszó" mechanizmusaival..

Az enzimatikus vágás során a DNS mindegyik szálának foszfodiészterkötése a restrikciós enzimek egyik aktív helyén helyezkedik el. Ha az enzim elhagyja a felismerési és vágási helyet, akkor ez nem specifikus átmeneti szövetségeken keresztül történik.

típus

Jelenleg öt típusú restrikciós enzim ismert. Az alábbiakban röviden ismertetjük mindegyiket:

I. típusú restrikciós enzimek

Ezek az enzimek nagy pentamerikus fehérjék, három alegységgel, restrikcióval, metilálással és egy másik a DNS-szekvenciák felismeréséhez. Ezek az endonukleázok a többfunkciós fehérjék, amelyek képesek a restrikciós és módosítási reakciók katalizálására, ATPáz aktivitással és DNS topoizomerázzal rendelkeznek..

Az ilyen típusú enzimek voltak az első endonukleázok, amelyeket először fedeztek fel, először az 1960-as években tisztították, és azóta nagy mélységben vizsgálták őket..

Az I. típusú enzimeket nem használják széles körben biotechnológiai eszközként, mivel a vágási hely változó távolságban lehet legfeljebb 1000 bázispár között a felismerési helytől, ami megbízhatatlanná teszi a kísérleti reprodukálhatóságot..

II. Típusú restrikciós enzimek

Ezek olyan enzimek, amelyek homodimerekből vagy tetramerekből állnak, amelyek 4 és 8 bp közötti hosszúságú DNS-t vágnak le. Ezek a vágási helyek tipikusan palindromikusak, vagyis azonos szekvenciákat ismernek fel mindkét irányban.

A baktériumokban a II. Típusú restrikciós enzimek közül sokan DNS-t vágnak el, amikor felismerik idegen jellegüket, mivel nem rendelkeznek a saját DNS-nek megfelelő tipikus módosításokkal..

Ezek a legegyszerűbb restrikciós enzimek, mivel nem igényelnek más magnéziumot (Mg +) tartalmazó kofaktorokat a DNS-szekvenciák felismerésére és vágására.

A II. Típusú restrikciós enzimek pontossága az egyszerű szekvenciák felismerésében és vágásában a DNS-ben pontos pozícióban teszi őket a molekuláris biológia legtöbb ágának egyik legelterjedtebb és elengedhetetlenebbé..

A II. Típusú csoporton belül a restrikciós enzimek több olyan alosztályt alkotnak, amelyek az egyes egyedek egyedi tulajdonságai szerint vannak besorolva. Ezeknek az enzimeknek az osztályozása az ábécé betűinek hozzáadásával történik, az A-tól Z-ig az enzim nevét követve.

A hasznosságuk közül a legismertebb alosztályok közül néhány:

IIA. Alosztály

Ezek különböző alegységek dimerei. Ismerik az aszimmetrikus szekvenciákat, és ideális prekurzorként használják a vágóenzimek előállításához.

IIB. Alosztály

Egy másik dimerből állnak, és a DNS-t a felismerési szekvencia mindkét oldalán levágják. A DNS mindkét szálát a bázispárok tartományában vágják le a felismerési hely felett.

IIC alosztály

Az ilyen típusú enzimek a DNS-szálak szétválasztásával és módosításával ellátott polipeptidek. Ezek az enzimek mindkét szálat aszimmetrikusan vágják.

IIE. Alosztály

Ennek az alosztálynak az enzimjei a leggyakrabban használtak a géntechnológiában. Katalitikus helyük van, és általában alloszterikus effektorra van szükségük. Ezeknek az enzimeknek hatékonynak kell lenniük a felismerési szekvencia két példányával. Ezen alosztályon belül az EcoRII és az EcoRI enzimek szerepelnek.

III. Típusú restrikciós enzimek

A III. Típusú restrikciós endonukleázok csak két alegységből állnak, az egyik felelős a DNS felismeréséért és módosításáért, míg a másik a szekvencia vágásáért felelős..

Ezeknek az enzimeknek a működéséhez két kofaktor szükséges: ATP és magnézium. Az ilyen típusú restrikciós enzimek két aszimmetrikus felismerési helyet tartalmaznak, áthelyezik a DNS-t ATP-függő módon, és 20 és 30 bp közötti távolságra vágják el a felismerési hely mellett..

IV. Típusú restrikciós enzimek

A IV. Típusú enzimek könnyen azonosíthatók, mivel a DNS-t metilációs jelöléssel vágják le, több különböző alegységből állnak, amelyek felelősek a DNS-szekvencia felismeréséért és vágásáért. Ezek az enzimek GTP és divalens magnézium kofaktorokként használhatók.

A vágás specifikus helyei közé tartoznak a nukleotidláncok, amelyek metilezett vagy hidroxi-metilezett citozin maradékai a nukleinsavak egy vagy mindkét szálában.

V. típusú restrikciós enzimek

Ez a besorolás a CRISPER-Cas típusú enzimeket csoportosítja, amelyek specifikus DNS-szekvenciákat azonosítanak és megszakítanak a behatoló szervezetekből. A Cas enzimek a CRISPER szintetizált irányító RNS szálát használják fel a behatoló szervezetek felismerésére és támadására.

Az V. típusba besorolt ​​enzimek az I, II és II típusú enzimek által strukturált polipeptidek. Szinte minden szervezet DNS-jének vágásait nagy hosszúságú tartományban tudják vágni. Rugalmasságuk és könnyű használatuk miatt ezek az enzimek a II. Típusú enzimekkel együtt ma a géntechnológia egyik leggyakrabban használt eszköze..

Példák

A DNS-polimorfizmusok kimutatására restrikciós enzimeket alkalmaztunk, különösen a populációgenetikában és a mitokondriális DNS-t használó evolúciós vizsgálatokban, a nukleotid-szubsztitúciók sebességére vonatkozó információk megszerzése érdekében..

Jelenleg a különböző célokra szolgáló baktériumok transzformálására használt vektorok többlépcsős helyeket tartalmaznak, ahol több restrikciós enzim felismerési helyei találhatók..

Ezek közül az enzimek közül a legnépszerűbbek az EcoRI, II, III, IV és V, amelyeket először kaptunk és írtunk le E. coli; HindIII H. influenzae és BamHI B. amyloliquefaciens.

referenciák

  1. Bickle, T. A. és Kruger, D. H. (1993). A DNS-korlátozás biológiája. Mikrobiológiai felülvizsgálatok, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A. és Horvath, P. (2007). CRISPR biztosítja a prokarióták vírusainak ellenállását. tudomány, 315(Március), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). A molekuláris perspektíva: restrikciós endonukleázok. Szövetsejtek a rákgyógyászat alapelvei, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Csúszás, ugrás és hurokozás restrikciós enzimekkel. Biokémiai Társasági tranzakciók, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). A fajok azonosságának megőrzése és a baktériumok spekulációjának ellenőrzése: a restrikciós / módosítási rendszerek új funkciója? gén, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., és Kilpatrick, S. (2018). Lewin gének XII (12 szerk.). Burlington, Massachusetts: Jones és Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Az I. és III. Típusú CRISPR-Cas rendszerek felhasználása a genom szerkesztéséhez. Nukleinsavak kutatása, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A. és Wilson, G. G. (2013). I. típusú restrikciós enzimek és rokonai. Nukleinsavak kutatása, 1-25.
  9.  Nathans, D. és Smith, H. O. (1975). Az endonukleázok restrikciója a DNS molekulák elemzésében és szerkezetátalakításában. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M. és Tajima, F. (1981). A restrikciós endonukleázokkal kimutatható Dna polimorfizmus. genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. és Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences II. Típusú restrikciós endonukleázok: szerkezet és mechanizmus. CMLS Cellular és Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Hogyan váltak a restrikciós enzimek a molekuláris biológia munkatársaira. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J. és Murray, K. (1976). Restrikciós endonukleázok. Kritikus vélemények a biokémia területén, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Homingos endonukleáz szerkezet és funkció. A biofizika negyedéves áttekintése, 1-47.
  15.  Tock, M. R. és Dryden, D. T. F. (2005). A korlátozás és a korlátozás biológiája. Jelenlegi vélemény a mikrobiológiában, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G. és Murray, N. E. (1991). Korlátozó és módosító rendszerek. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. és Mou, K. (2016). Genomiális betekintés a Campylobacter jejuni virulenciájába és a populációs genetikába. Megfertőzni. Dis. Transz. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). A multifunkcionális restrikciós endonukleázok szerkezete és mechanizmusa. Annu. Biochem., 50, 285-315.