Bakteriális kenet jellemzői és előkészítése



az bakteriális kenet a bakteriális mikroorganizmusok szuszpenziójának vékony fóliája, amelyet átlátszó üveglemezen vagy tárgylemezeken hajtunk végre, optikai mikroszkóp alatt történő megfigyelés céljából..

A film formájú kiterjesztése a mikroorganizmusok lehető legnagyobb mértékű elválasztása céljából történik, mert ha csoportosítják, a megfigyelés nem egyértelmű.

A baktériumkultúrák tanulmányozásában a kenet előkészítésének, rögzítésének és színezésének módszereit használják fel jobban elemezni. A mikroorganizmusok kis mérete miatt az optikai mikroszkóp használata szükségszerűen szükséges annak megfigyeléséhez.

Az optikai mikroszkópok elengedhetetlen eszközök a kenet megfigyeléséhez. Ezek optikai lencséket és fényt használnak, amelyek lehetővé teszik a minták nagy méretarányos megjelenítését.

Általában az élő sejtek nem rendelkeznek olyan szerkezetekkel, amelyek többnyire színesek, az optikai mikroszkópon keresztül láthatók, színtelen, átlátszó minták, és nagyon kevés belső kontrasztot mutatnak, és környezetükkel.

Az egyszerű fénymező mikroszkóp segítségével történő megfigyelés segédfestési technikák használata nélkül nagyon korlátozott, és csak bizonyos esetekben használatos, mint a mikroorganizmusok mozgásának megfigyelése során..

A mikroorganizmusok optimális megfigyeléséhez egyensúlyt kell teremteni a kontraszt és a felbontás között. A sejtek részleteit nem lehet mikroszkóp alatt megfigyelni, még nagy felbontásban is; a festékek használatát festési technikákkal kell elvégezni, amelyek kontrasztot biztosítanak a megfigyeléshez.

index

  • 1 Jó minőségű bakteriális kenet jellemzői
    • 1.1 Kiváló kontraszt
    • 1.2 Jó javítás
    • 1.3 Jó festés
  • 2 Előkészítés
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Rögzítés
    • 2.3 C. Egyszerű festés
    • 2.4 D. A kenet végleges megőrzése
  • 3 Referenciák

Jó minőségű bakteriális kenet jellemzői

Kiváló kontraszt

A kiváló kontraszt eléréséhez kifinomult mikroszkópokat hívnak fázis kontrasztmikroszkóp, differenciál interferencia és sötétmikroszkóp. Ezt a fajta mikroszkópot használják bakteriális struktúrák, például köpenyek és szálak megfigyelésére.

A festés egy egyszerű technika, amely növeli a tiszta mikroszkóp segítségével elért kontrasztot. Ebben a technikában különböző színezékek használhatók, amelyek észrevehetően javítják a mikroszkóp alatt végzett megfigyelést.

A foltok közvetlenül a mikroorganizmusok szuszpenzióinak szennyeződésein vagy kiterjesztésein készülnek a korábban szárított és rögzített tárgylemezeken..

Jó javítás

A rögzítés olyan technika, amelyet a sejtszerkezetek megőrzésére használnak; okozza a mikroorganizmusok inaktiválódását és tapadást a tárgylemez üvegéhez. Különböző rögzítési kezelések vannak: a hő rögzítése és a kémiai rögzítés.

Hő rögzítése

Ez a módszer a leggyakrabban használt a baktérium kenet megfigyelésére. A technika szerint a kenet bakteriális szuszpenzióját egy könnyebb láng átviszi. Ez a technika képes megőrizni a baktériumok külső morfológiáját, de elpusztítja belső szerkezetüket.

Kémiai rögzítés

A kémiai rögzítés vegyi anyagokat használ, például formaldehidet vagy formaldehidet, etanolt és ecetsavat. A kémiai kötőanyagok alkalmazásának előnye, hogy a mikroorganizmusok belső sejtstruktúráinak megőrzése megtörténik.

Jó festés

A korábban szárított és rögzített kenet festésére a leggyakoribb eljárások a pozitív vagy egyszerű festés, a differenciálfestés és a negatív festés. Speciális technikák is vannak bizonyos sejtstruktúrák festésére (kapszula, spóra, flagella).

Pozitív festés vagy egyszerű festés

A pozitív vagy egyszerű festés a leggyakrabban használt festékszennyeződés technika. Olyan festékeket használ, amelyek képesek bizonyos mikrobiális struktúrákhoz kötődni, lehetővé téve, hogy mikroszkóp alatt megfigyelhessék őket.

Ezeknek a színezékeknek kémiai szerkezetükben kromoforos csoportok (színes rész), váltakozó kettős kötésekkel és egyszerű kötésekkel (konjugációval) rendelkeznek. Ezek a kötések viszont ionos vagy kovalens kötéseket hozhatnak létre néhány sejtszerkezettel.

A pozitív vagy egyszerű festés során használt színezékek többnyire kémiai származékai anilin (színes szerves sók).

Másrészről a színezékek között találunk néhányat bázikus pH-val és mások savanyú pH-val.

Alap színezékek

Bázikus festékekben a kromofór csoport pozitív elektromos töltéssel rendelkezik. A prokarióta mikroorganizmusok túlnyomó többsége semleges belső pH-val rendelkezik, és sejtfelületeik negatív töltésűek. Ezzel az elektrosztatikus kölcsönhatással a kromofor kötődik a sejthez és színez.

Bázikus színezékek például a metilén-kék, a lila kristály, a malachit zöld, az alapfuscin, a safranin, többek között.

Savas festékek

Savfestékekben a kromofór csoport negatív elektromos töltéssel rendelkezik. Ezeket pozitív töltésű aminocsoportokkal rendelkező fehérjék festésére használjuk. A savas festékekre példaként említhető a sav-fuscin, a bengáli rózsa, a kongói vörös és az eozin.

Különböző festés

A differenciálfestés technikája két különböző szín vagy intenzitású színezék alkalmazása, a mikroszkóp alatt a különböző mikroorganizmusok megkülönböztetésére. A baktériumok leggyakrabban használt differenciálfoltja a Gram-folt és a sav-alkohol-rezisztencia festés.

A Gram-foltot előzetes tesztként használjuk, hogy megismerjük a sejttípus típusát, méretét, sejtcsoportját. A Gram festékvizsgálat révén a sejtfalú baktériumok Gram-pozitív baktériumok és Gram-negatív baktériumok.

Negatív festés

Ebben a technikában olyan kémiai festékeket használnak, amelyek nem hatolnak be a sejtek belsejébe, de azt teszik, hogy a közeg, amelyben a mikroorganizmusok fekete háttérként jelennek meg.

A negatív festés technikájában a kenetet kínai tinta vagy nigrosin szuszpenziójának cseppével állítjuk elő, amely szobahőmérsékleten történő szárítás után a fény áthaladását nem átlátszó fóliát képez. Ily módon a mikroorganizmusokat sötét háttéren fényes formáknak tekintik.

előkészítés

A. Kenet

1.- Mossuk le a tárgylemezeket nagyon jól, szárítsuk meg abszorbens papírral, és jelöljük meg őket. A címkén fel kell tüntetni a készítmény tartalmát, a dátumot és annak feldolgozójának nevét.

2.- Gyújtsa meg a könnyebbet, és sterilizálja a lángban lévő oltási hurkot, amíg a vörös forró.

3.- Hagyja lehűlni a fogantyút.

4.- Vegye ki a baktériumkultúra csövet, vegye le a kupakot, és gyorsan haladjon át a cső szájánál az öngyújtó lángja közelében (láng).

5.- Vigye be a beoltási hurkot a baktériumkultúrát tartalmazó cső belsejében, és vegye be a mintát.

6.- Ha a tenyészet folyékony közegben van, helyezze a mintát a fogantyúval a csúszka közepére, és óvatosan tegye körbe, körülbelül 2 cm átmérőjű körben..

7.- Az inokulációs hurok sterilizálása.

8.- Szennyeződés megszárítása a levegőben.

9.- Ismételje meg a 3–8. Lépéseket háromszor.

10.- Ha a tenyészet szilárd tápközegben van, akkor egy csepp desztillált vizet kell elhelyezni a lemezre. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a tenyészetből vett kis mintát összekeverjük a beoltás fogantyújával, a 2-5. Lépések (aszepszis körülményei) szerint..

11.- Húzza ki a hígított mintát a csúszda vízcseppével, és ismételje meg háromszor.

B. Rögzítés

1.- Adjunk hozzá a száraz kenőcsökhöz - folyékony közegekből, két csepp metanolból vagy abszolút etanolból előállított tenyészetekből..

2.- Hagyja száradni a levegőben az öngyújtótól.

3.- Ha a kenetet szilárd táptalajból származó tenyészetből származtatjuk, a száraz kenetet hevítéssel rögzítjük, amely 2-3-szor gyorsabban halad át az öngyújtó lángjának legmelegebb területén..

4.- Érintse meg a kenet alsó részét a bal kéz hátsó részével (jobbkezes, egyébként jobb oldali), és ellenőrizze, hogy hideg-e.

C. Egyszerű festés

1.- Adjon hozzá 2 csepp választott festéket a kenethez, és hagyja, hogy az egyes festékek egyedi protokolljaiban előírt ideig működjön (általában 1 és 5 perc között).

2.- Bizonyos színezékek hőkezelését igénylik az aktiválásukhoz, amely esetben nagyon óvatosnak kell lennie a csúszka fűtésében az öngyújtó lángjában (csipesszel manipulálni és elkerülni a forralást). A kenet túlmelegedése elpusztíthatja a megfigyelni kívánt sejteket.

3.- Távolítsuk el a felesleges festéket egy desztillált vízzel való mosással. Távolítsa el a mosóvizet úgy, hogy óvatosan megérinti a csúszkát a szélén, és döntött a munkaasztalon.

4.- Légszárítás engedélyezése.

5.- A megfigyelés típusától függően ebben a szakaszban fedőlapot használnak. A fedőlap védi és megőrzi a kenetet. Ha ebben a szakaszban olajba merítéssel történik megfigyelés, nem használnak fedőlapot, de a kenetet nem lehet megőrizni.

D. A kenet végleges megőrzése

1.- Az oltóanyagot az alábbiakban felsorolt ​​valamennyi oldatban legalább 5 percig merítse le. Ezen "fürdők" célja, hogy a kenet teljesen kiszáradjon. Minden reagenset le kell üríteni, mielőtt a következő kádba beviszik a kenetet.

A szárító fürdők sorrendje a következő:

  1. Etanol 70%
  2. 95% -os etanol
  3. Tiszta aceton
  4. Az aceton-xilol 1: 1 arányú elegye
  5. xilol

Ezután engedje meg a levegő szárítását.

2.- Szerelje fel a fedőlapot, lehetőleg 22 × 22 mm-t, kanadai balzsam vagy más szerelési eszköz segítségével.

referenciák

  1. Briggs, G. (1965). A mikrobiológiai laboratóriumi balesetek és fertőzések okozati okai. Amerikai hadsereg biológiai laboratóriumai. Detrick erőd.
  2. Cappucino, J.G. és Welch, C.T. (2017). Mikrobiológia: laboratóriumi kézikönyv. Pearson.
  3. Holt, J.G. Szerkesztő. (1977). A rövidebb Bergey meghatározó bakteriológiai kézikönyve. 8th Baltimore: The Williams és Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. és Case; C. L. (2018). Laboratóriumi kísérletek mikrobiológiában. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnosztikai mikrobiológia. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc..