DNS-szekvenálás Maxam-Gilbert, Sanger-módszer, példák



az DNS szekvenálás (dezoxiribonukleinsav) a molekuláris biológiai laboratóriumokban végzett eljárás, amely lehetővé teszi a nukleotidok sorrendjének megismerését a kérdéses genetikai anyagban. Ezenkívül az RNS (ribonukleinsav) szekvenálása is kimutatható.

Ez a technika elengedhetetlen a biológiai tudományok fejlődéséhez. Alkalmazható más tudásterületekre is, mint például az orvosi diagnózis és az igazságügyi vizsgálatok.

Korábban a DNS-szál szekvenálása lassú és drága aktivitásnak tekinthető, amely lehetővé tette, hogy csak néhány bázispár azonosuljon az oligonukleotidokban..

Napjainkban, a tudomány minden előrehaladásával, a DNS szekvenálás a világ számos laboratóriumában rutinszerű működés, az ezen a területen végzett közel 50 éves kutatásnak köszönhetően. Ami a lánc hosszát illeti, nagyon rövid idő alatt sorozhat fel több millió bázispárra.

Ehhez több tucat technikát fejlesztettek ki, amelyek az ártól és a pontosságtól függenek. Ebben a cikkben klasszikus és modern technikákat írunk le, amelyek mindegyike előnyei és hátrányai.

Eddig a szekvenálási technikák lehetővé teszik a teljes genomok szekvenciájának megszerzését, kis prokariótáktól és élesztőktől az emberi genomig.

index

  • 1 A DNS szerkezete
  • 2 Történelem
  • 3 Sanger módszer
    • 3.1 A reakció fő összetevői
    • 3.2 Az eredmények olvasása
  • 4 Automatikus szekvenálás
  • 5 Maxam-Gilbert szekvenálás
    • 5.1 Eljárás
    • 5.2 Az eredmények olvasása
  • 6 Masszív szekvenálás
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Szekvencia szekvenálással
    • 6.3 Szekvenálás ligálással
    • 6.4 Az Ion Torrent sorrendje
  • 7 Példák
    • 7.1 Az emberi genom szekvenálása
  • 8 Fontosság és alkalmazások
  • 9 Referenciák

A DNS szerkezete

A DNS-szekvenáláshoz használt módszerek és technikák megértéséhez meg kell ismerni a molekula szerkezetének és összetételének bizonyos kulcsfontosságú aspektusait.

A DNS az összes élőlényben megtalálható biomolekula, a baktériumoktól a nagy vízi állatokig. A organellák - mint a mitokondriumok és a kloroplasztok - körkörös DNS molekulájuk van benne. Még néhány vírusban is megtalálható a DNS.

Szerkezetileg a DNS nukleotidok halmaza. Mindegyiküket egy szénhidrát, egy nitrogénbázis (A, T, C vagy G) és egy foszfátcsoport integrál. A DNS szekvenálás célja, hogy feltárja azt a sorrendet, amelyben a négy nitrogén bázist megtaláljuk a szekvenciában.

történelem

Az 1950-es évek közepén Watson és Crick kutatók a DNS szerkezetét a krisztológiai technikák segítségével írják le. A kutatók egyike sem tudta megtalálni a szekvenciát.

Bár voltak elődei is, a legfontosabb esemény Sanger módszerének megalkotása volt, 1977-ben. Frederick Sanger, a módszer apja brit biokémikus volt, két Nobel-díjat nyert a biológiai tudományokhoz való hatalmas hozzájárulásáért..

Ez a technika a szakirodalomban "láncvégződés" vagy dideoxinukleotidokként is ismert. Ezután ismertetjük ennek a technikának az elveit és azokat, amelyeket ennek fejlesztése és innovációja alapján fejlesztettek ki.

Sanger-módszer

A Sanger-módszer kifejlesztése kulcsfontosságú eseményt jelentett a molekuláris biológiában. Ez magában foglalja a DNS replikációs folyamat alapkomponenseit, amelyek általában a sejtben fordulnak elő, de egy speciális komponens: dideoxinukleotidok hozzáadásával.

A reakció fő összetevői

- DNS-polimeráz: a DNS-polimeráz enzim döntő eleme a folyamatnak. Ez a molekula részt vesz a DNS-szál replikációjában, és szerepe az új lánc szintézise, ​​a dezoxiribonukleotid-trifoszfátnak a komplementerekkel való összehangolásával..

Ne feledje, hogy a DNS-ben a timineket (T) két hidrogénkötés segítségével párosítjuk az (A) adeninnel, míg a citoszin (C) a guaninnal (G) három híddal történik..

- Nukleotidok: A Sanger szekvenálás kétféle nukleotidot, a négy 2'-dezoxinukleotidot (rövidítve dATP, dGTP, dCTP és dTTP) és a négy dideoxinukleotidot (ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP) tartalmaz..

Bár a dideoxinukleotidok hasonlítanak a normál DNS-be beépített monomerekre, a struktúrájukban nincs -OH csoport. Ez lehetetlenné teszi egy új nukleotid hozzáadását a lánchoz.

Ezért, amikor egy speciális nukleotidot adunk hozzá - teljesen véletlenszerűen - a kialakuló lánchoz, a szintézis megbénul. Ily módon a reakció végén különböző méretű láncok vannak, amelyek mindegyike olyan, ahol a reakciót egy másik ponton leállítjuk.

Kísérleti úton négy próba készül. Mindegyik tartalmazza a biológiai mintából kinyert DNS-t, a normális nukleotidokat és a speciális nukleotidok négy típusát. Vagy a speciális nukleotidok valamilyen fluoreszcens jelölővel vannak jelölve (lásd az automatizált szekvenálást alább).

Az eredmények olvasása

Az első lépés az egyes szintetizált láncok méretének elválasztása. Néhányan hosszabbak lesznek, mint mások, attól függően, hogy a speciális bázisok hol voltak.

Különböző biokémiai technikák léteznek, amelyek lehetővé teszik a keverék összetevőinek szétválasztását a mérettel diszkriminatív tulajdonságként. A Sanger-módszerben a különböző láncokat elektroforézissel választjuk el. A technika legfejlettebb változataiban kapilláris elektroforézist alkalmazunk.

Így a hosszabb szálak kevesebb, mint a rövidebb változatok. Ezután a rendszer áthalad egy olyan olvasón, amely felismeri az egyes dideoxinukleotidokban található markereket. Ily módon a szekvencia sorrendje ismert.

Ez az "első generációs" technika képes olyan DNS-fragmentumok olvasására, amelyek nem nagyobbak, mint 1 kilobázis. Jelenleg a Sanger módszerét több laboratóriumban használják, általában a modern változatokban. Ezenkívül a legösszetettebb technikákkal - de kevésbé pontosakkal - kapott eredményeket megerősítik.

Automatikus szekvenálás

Ha nagyszabású szekvenálásra van szükség, az eljárást az automatizálás gyorsítja. Ez a Sanger láncterminálási módszer változata, ahol a primerek fluoreszcens termékekkel vannak jelölve, hogy megkülönböztessék őket.

Ezt követően a reakció termékét elektroforézissel hajtjuk végre - mindössze egyetlen sávban. Ha minden egyes fragmens elhagyja a gél végső részét, akkor a fluoreszcens címke gyorsan azonosítja azt 1% -os hibával..

A legkifinomultabb rendszerek legfeljebb 96 kapilláris csővel rendelkeznek, amelyeket a robothoz csatlakoztatott számítógép működtet. Ez azt jelenti, hogy 96 DNS-mintát lehet egyidejűleg értékelni. Így az elektroforézis és az eredmények elemzése teljesen automatizált.

Egy nap alatt ezek a rendszerek legfeljebb 550 000 bázist sorolhatnak be. A folyamat során az emberi munka szükségtelen, csak 15 percet vesz igénybe a módszer elindításához.

Maxam-Gilbert szekvenálása

Ugyanakkor Sanger kiadta munkáját, két kutató, Allan Maxan és Walter Gilbert, sikerült egy másik módszert kifejleszteni a DNS-szekvencia megszerzésére. A módszer akkoriban népszerűségre tett szert, de később a Sanger-módszer javítása révén eltávozott.

A Sanger-módszerrel ellentétben a Maxan és a Gilbert szekvenálása (vagy a kémiai szekvenálás, mint ismert) nem jár hibridizációs reakciókkal. A módszer a reaktív ágensek egyik végén történő jelölését, majd a tisztítási folyamatot jelenti.

Ennek a technikának az egyik negatív aspektusa az óriási összetettsége és a felhasználó számára veszélyes vegyi anyagok használata. A kémiai bomlást DMS, hangyasav, hidrazin és hidrazin sókkal történő alkalmazásával indukáljuk.

folyamat

A protokoll a szál 5'-végén lévő jelöléssel kezdődik a 32 foszforjelzővel, majd a nitrogénbázis kémiai módosítása következik be és elválik. Végül megtörténik az abasic régió felosztása.

Először a szekvenálandó lánc kisebb szegmensekké válik. Ezt a lépést restrikciós enzimekkel hajtjuk végre, amelyek kiemelkedő szélsőségeket eredményeznek.

Ezután a reakciót lúgos foszfatázzal hajtjuk végre, amelynek célja a foszfátcsoport eltávolítása. Tehát egy polinukleotid kináz használható a jelölés végrehajtására.

A lánc denaturált (a két szál nyitva van). Ezután folytatjuk a vegyszerek alkalmazását. Ezeket a hasítási reakciókat szabályozott módon hajtjuk végre, és az alkalmazott vegyi anyagok milyen típusú kötéseket törnek össze.

Az eredmények olvasása

A Sanger-módszerhez hasonlóan az eredmények leolvasása magában foglalja az elektroforézis rendszerben kapott láncok méret szerinti elválasztását. A poliakrilamidból álló rendszerek lehetővé teszik, hogy a gél olvasásához nagyon megfelelő felbontást kapjunk.

Masszív szekvenálás

A masszív szekvenálás magában foglalja az új módszerek sorozatát, rövidítve NGS-ként, angolul.Következő generációs szekvenálás ".

Az NGS-ként katalizált módszerek egy korábbi DNS-amplifikációs lépést igényelnek (nem működnek egyetlen molekulával). Emellett a felhasznált platformok igen eltérőek. A legnépszerűbb módszerek elveit az alábbiakban ismertetjük:

piroszekvenálás

Ez magában foglalja a pirofoszfát felszabadulásának figyelemmel kísérését, amely minden alkalommal egy új nukleotid hozzáadásával történik a DNS-szálhoz. Egy enzimrendszert összekapcsolunk, hogy a fénykibocsátás (amely egy kamerával detektálható) minden egyes új nukleotid beépítésekor bekövetkezik..

Az eljárás minden egyes nitrogénbázis külön inkubálásával kezdődik annak ellenőrzésére, hogy van-e fénykibocsátás. A pirosquencing a hosszú szálak olvasását elvégezheti, de a talált hibaarány magas.

Szekvenálás szintézissel

Ez magában foglalja a jelölt nukleotidok beépítését. Ezeket a fluoreszcens komponenseket hozzáadjuk, mossuk és a beépített nukleotidot feljegyezzük. Ezután a nukleotid jelölés megszűnik, és a szál szintézise folytatódhat. A következő lépésben egy jelölt nukleotidot is beépítünk, és az említett lépéseket megismételjük.

Ennek a technikának egy hátránya akkor fordul elő, ha a fluoreszcens markerek nem teljesen eliminálódnak. Ezek a kibocsátások háttérhibákat okoznak, ami jelentős hibákat eredményez.

Szekvenálás ligálással

Ez a technika különbözik a többitől, mivel nem használja a DNS-polimerázt. Ehelyett ennek a módszernek a legfontosabb enzimje a ligáz. Itt olyan fluoreszcensen jelölt DNS-fragmenseket használunk, amelyeket az enzim köt, és detektálunk.

Ennek a technikának a legnagyobb problémája a feldolgozásra képes fragmentum nagyon rövid hossza.

Ion szekvenálás Torrent

Ez a technika a H ion mérésére épül+ amely egy új nukleotid beépítése után szabadul fel. Az elv meglehetősen hasonlít a pirosequencingra, de sokkal olcsóbb.

Példák

Az emberi genom szekvenálása

Az emberi genom szekvenálása a biológia egyik legígéretesebb kihívása, valamint a tudománytörténet egyik legelismertebb versengése. Valójában a projektben résztvevő tudósok számára a genom szekvenálása verseny lett.

1990-ben elindította az úgynevezett "humán genom projektet", amelyet a híres tudós, a Nobel-díjas, James Watson vezette. Egy év múlva, 1991-ben, Venter a Watson "verte" és az előtte lévő genom szekvenálásának kihívását veszi át. 1992-ben azonban Watson visszavonult, és a parancsot egy másik kutató vette át.

1995-ben a Venter bejelentette, hogy a véletlenszerű szekvenálási módszerrel sikerült bakteriális genomot teljes egészében szekvenálni. Hasonlóképpen, az ellenkező csapat egy évvel később bejelentette az élesztő genom szekvenálását.

2000-ben megszűnt a verseny. Mindkét vállalat közzétette a teljes genom előzetes eredményeit a tudomány két legrangosabb folyóiratában: természet és tudomány.

A tudósok azonban tovább dolgoztak a javaslatok javításán, és 2006-ban a szekvenciák bizonyos emberi kromoszómákra kerültek.

Fontosság és alkalmazások

A biológusok és a hozzá kapcsolódó szakemberek számára a molekula annyira fontos nukleotidok sorrendjének ismerete, mint a DNS. Ez a polinukleotidlánc az összes életforma kialakításához és fenntartásához szükséges összes információt tartalmazza.

Ezen okok miatt a szekvencia ismerete elengedhetetlen a biológiai kutatáshoz. Alapvetően a szekvenálás lehetővé teszi, hogy mérjük a biológiai rendszerek egyik legfontosabb tulajdonságát, és megállapítsuk a közöttük lévő különbségeket.

A szekvenálást széles körben használják a taxonómikusok és a szisztematikusok, mivel bizonyos DNS-szekvenciák lehetővé teszik a kritériumok megállapítását annak megállapítására, hogy két organizmus ugyanahhoz a fajhoz tartozik-e vagy sem, és képes-e hipotéziseket javasolni a közöttük fennálló filogenetikai kapcsolatokra..

Ezen túlmenően a DNS-szekvenálás alkalmazásai vannak az orvostudomány és a diagnosztika területén. Például megfizethető és hozzáférhető rendszerek vannak, amelyek a szekvenálás révén lehetővé teszik bizonyos betegségek (pl. Rák) kifejlődésének tendenciáját az úgynevezett egyszerű nukleotid polimorfizmusok (SNP) alkalmazásával..

A bűnözés és a kriminalisztika vizsgálata szintén a szekvenálás technikáival gazdagodott, és megbízható bizonyítékként használhatók egy adott személy bűncselekményben való részvételére..

referenciák

  1. Heather, J. M. és Chain, B. (2016). A szekvenáló szekvenciája: a DNS szekvenálásának története. Genomics, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. A szekvenáló forradalom következő generációja és hatása a genomikára. sejt, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Tudományos rivalizálás. A Galileo-tól az emberi genom projektig. Paraninfo Szerkesztés.
  4. Sanger, F., Nicklen, S. és Coulson, A. R. (1977). DNS-szekvenálás láncvégző inhibitorokkal. A nemzeti tudományok akadémiája, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). A következő generációs szekvenálás átalakítja a mai biológiát. Természeti módszerek, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (szerk.). (2014). Következő generációs szekvenálás. Caister Academic Press.