Proteináz K jellemzői, enzimatikus aktivitás és alkalmazások

az proteináz K egy olyan enzim, amely a szerinproteázok csoportjába tartozik, vagyis aktív katalitikus centrumában egy aminosav szerin, és a peptidkötések hidrolízissel történő megszakítása. Ez az enzim a fehérjék szubtilizinek (peptidáz S8) családjába tartozik..

A proteáz K molekulatömege (MW) 28 900 dalton volt, és először 1974-ben izolálták a gomba kivonataiból. Engyodontium album, korábban ismert nevén Tritirachium album Limber.

Magas proteolitikus kapacitással rendelkezik, kimutatták, hogy képes a hajban lévő keratint lebontani. A keratin angol szó "keratin", ezért "proteináz K" -nek nevezték..

A natív fehérjék hasítási képessége miatt ez az enzim hasznos a különböző molekuláris biológiai technikákban. Elsősorban nagy molekulatömegű (MW) nukleinsavak izolálására és előállítására használják..

A proteáz K úgy hat, hogy felszabadítja a nukleáris DNS-t, miközben elpusztítja a fehérjéket és inaktiválja az RNázokat és a DN-ázokat, vagyis megszünteti a nukleázokat a DNS és az RNS készítményekben..

Másrészt azt tapasztaltuk, hogy a proteináz K néhány denaturált natív fehérjét képes hidrolizálni, ami felkeltette a kutatók érdeklődését a prionfehérjék (PrPC) tanulmányozásában való alkalmazására..

Magas proteolitikus hatékonysága ellenére azonban vannak olyan fehérjék, amelyek rezisztensek a K. proteináz hatásával. Ezek között vannak olyan kóros fehérjék, amelyeket prionoknak (PrPSc) neveznek, amelyek a fertőző szivacsos agyvelőbántalmakhoz kapcsolódnak..

index

• 1 A proteináz K jellemzői
• 2 Enzim aktivitás
• 3 Alkalmazások
• 4 A proteináz K előnyei
• 5 Proteináz-rezisztens fehérjék K
• 6 Referenciák

A proteináz K jellemzői

A proteáz K-nak három rétegből álló harmadlagos szerkezete van, és egy hét láncból álló β-lap van elosztva két hélix réteg között. Mivel az S8 peptidázok családjába tartozik, az aktív helyén katalitikus triád jellemzi, amelynek szekvenciális sorrendje (Asp, His és Ser), amely megkülönbözteti őket a peptidázok más családjaitól..

A szerin-proteázok csoportjából származó enzimet úgy jellemezzük, hogy a peptidkötéseket az alifás és aromás aminosavak karbonsavcsoportjához közel hidrolizálják..

Másrészről bizonyos korrozív anyagok, például nátrium-dodecil-szulfát (SDS), Tris-HCL és EDTA jelenlétében képes fellépni, amelyek segítik a fehérjék denaturálását, és így elveszítik natív szerkezetüket..

Ez egy előzetes lépés a fehérjék előállításához az elektroforézis technikához. A pH-tartomány, amelynél a proteináz K-aktivitás meglehetősen széles (2,0-12,0), az optimális pH-érték 7,5 és 12,0 között van, és izoelektromos pontja 8,9. Amint megfigyelhető, nagyon széles pH-tartományban aktív.

A proteináz K-ben kiemelkedő másik jellemzője a stabilitás magas hőmérséklet (50–60 ° C) jelenlétében..

Enzimes aktivitás

A proteáz K-nak kalciumion jelenlétére van szüksége, bár ez nem befolyásolja aktivitását, ha elengedhetetlen a stabilitásának fenntartása.

Ahhoz, hogy a proteináz K a szubsztrát teljes emésztését elvégezze, hozzávetőleges érintkezési idő szükséges 5 perc és 2 óra között..

Ebben az értelemben azonban Daza és munkatársai Összehasonlították a proteináz K többször megismert DNS tisztaságát, és arra a következtetésre jutottak, hogy a hosszabb ideig tartó inkubálás (akár 24 óra) jelentősen javítja a DNS minőségét..

Most, a proteináz K enzim különböző protokollokban alkalmazott koncentrációjával kapcsolatban elmondható, hogy nagyon változatos.

Nagyon alacsony koncentrációkból (5 μg / ml) 500 μg / ml koncentrációig alkalmazható. Azonban a leggyakoribb koncentráció 50-100 μg / ml között van, különösen a fehérjék emésztésére és a nukleáz inaktiválására. Bár a szövetkezeléshez 2 mg / ml koncentráció szükséges.

alkalmazások

Alkalmazásai nagyon szélesek, és az alábbiakban foglalhatók össze:

-Fehérje emésztéshez és DNS-extrakcióhoz többféle módszerrel, például: sózással, PK-SDS-sel, cetil-trimetil-ammónium-bromiddal (CTAB), módosított kálium-acetáttal és nátrium-jodiddal történő extrakcióval használják..

-A nukleázok inaktiválása (RNázok és DNázok).

-A hibridizációs technikában in situ (HIS), hogy segítsen felszabadítani a nukleinsavat, a nemkívánatos fehérjék eltávolítása mellett.

-Fehérje módosítása.

-Kutatási szinten, különböző tanulmányokban.

A proteináz K előnyei

Számos összehasonlító vizsgálatot végeztek a proteáz K-t alkalmazó DNS-extrakciós technikák között, másokkal, akik nem használják fel, és mindannyian arra a következtetésre jutottak, hogy az enzim használata nagyobb előnyökkel jár. Az előnyök közül az alábbiakat említhetjük:

-Nagy molekulatömegű, kiváló minőségű és tisztaságú DNS-t kapunk.

-Az extrahált DNS 3 hónapig stabil.

Az extrahált DNS-t a következő eljárásokban használhatjuk: Southern blot, polimeráz láncreakció (PCR), elektroforézis, többek között.

A proteináz K ellenálló fehérjék

Különböző vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy a prionok (abnormális PrPSc toxikus fehérjék) különböznek a PrPC fehérjéktől (natív), mert rezisztensek a proteináz K hatására, míg a PrPC érzékeny a hatásukra..

Más szerzők ismertették, hogy a PrPSc szerkezetében érzékeny részek és mások rezisztensek a proteináz K. ellen. Mindkét rész ugyanolyan mérgező és fertőző..

Másrészt a Bastian és a munkatársak 1987-ben 4, 28, 30, 66 és 76 kda fehérjét izoláltak egy fajból. Spiroplasma mirum. Mindegyik rezisztens volt a proteináz K hatására, és néhány prionnal is keresztreakció volt.

Ismert, hogy ez a faj szürkehályogot és fontos neurológiai károsodást okozhat, és a Bastian tudományos eredményei miatt, többek között a kísérletek során kísérletet tettek arra, hogy ezt a mikroorganizmust a fertőző szivacsos agyvelőbántalmakhoz kösse..

A degeneratív neurológiai patológia etiológiája azonban ma is a prionokhoz tartozik.

Ebben az értelemben Butler és munkatársai 1991-ben azonosítottak és jellemeztek egy 40 Kda proteináz-rezisztens protein K osztályt a két törzsből. Mycoplasma hyorhinis. Ez a kórokozó hatással van a sertésekre, megfertőzi a szöveteiket, de ebben az esetben nem volt keresztreakció a vizsgált prionokkal.

Több kutatásra van szükség ahhoz, hogy sok ismeretlen ismeretet szerezzen róla.

referenciák

1. Bastian F, Jennings R és Gardner W. 1987. Antiszerum a scrapie-vel társított fibrill proteinhez Spiroplasma mirum fibrilláris fehérjék. J. Clin. Microbiol. 25, 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. A DNS extrakciós és tisztítási módszereinek értékelése az izomszövetből, amelyet formaldehidben rögzítettek azonosítatlan kagylókból.  Med Magazine, 2014 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E és Mcgarrity G. Proteináz K-rezisztens fehérjék azonosítása és jellemzése a Mollicute osztály tagjaiban. Infection and Immunity, 59 (3), 1037-1042 (1991)
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. A DNS kivonásából származó két protokoll összehasonlítása Trypanosoma cruzi axenikus közegben termesztik. Rev. Peru. Med. Exp. Közegészségügy  2014 31 (2): 222-227. Elérhető: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E és Palma W. Öt DNS-extrakciós protokoll hatékonyságának meghatározása paraffin anyagból molekuláris vizsgálatokhoz. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007-ben; 1 (1): 10-19.