Giemsa festési alapítvány, anyagok, technika és felhasználás



az Giemsa folt a klinikai minták festésének típusa a sav és bázikus festékek keveréke alapján. Létrehozását a Romanowsky munkája inspirálta, ahol Gustav Giemsa, a németországi eredetileg kémikus és bakteriológus tökéletesítette a glicerin hozzáadásával a vegyületek stabilizálásához..

A Romanowsky eredeti technikájához kapcsolódó változások jelentősen javították a mikroszkópos megfigyeléseket, ezért a technika megkeresztelkedett Giemsa foltjal..

Mivel ez egy egyszerű technika, rendkívül funkcionális és gazdaságos, jelenleg széles körben használják a klinikai laboratóriumban hematológiai kenet, csontvelőminták és szövetrészek számára..

A Giemsa festési technika nagyon hasznos a citológiai vizsgálatokhoz, mivel lehetővé teszi a sejtek specifikus struktúráinak megfigyelését. Ez a technika a sejtek citoplazmáit, magjait, nukleoljait, vakuoljait és granulátumait megfestik, hogy megkülönböztesse a finom kromatin nyomokat..

Ezen kívül jelentős változások figyelhetők meg a mag méretében, alakjában vagy színében, ahol lehetséges a nukleáris-citoplazma kapcsolatának elvesztése..

Másrészt lehetővé teszi az éretlen sejtek azonosítását a csontvelőben és a perifériás vérben, ami fontos a súlyos betegségek, például leukémia diagnosztizálásához. Lehetőség van továbbá hemoparaziták, extra és intracelluláris baktériumok, gombák kimutatására is.

A citogenetikában meglehetősen használatos, mivel lehetséges a sejtek mitózisának vizsgálata.

index

  • 1 A Giemsa színezés alapja
  • 2 Anyagok
    • 2.1 Anyagok az anyaoldat elkészítéséhez
    • 2.2 Az anyaoldat elkészítési módja
    • 2.3 A pufferoldat elkészítéséhez szükséges anyagok
    • 2.4 A festék végső elkészítése
    • 2.5 A színezéshez szükséges további anyagok
  • 3 Technika
    • 3.1 Festési folyamat
  • 4 Segédprogramok
    • 4.1 Hematológia
    • 4.2 Mycology
    • 4.3 Bakteriológia
    • 4.4 Parazitológia
    • 4.5. Citológia
    • 4.6 Cytogenetika
  • 5 A Giemsa festés hatékonyságát bemutató kutatás
  • 6 Javaslatok a jó festésre
  • 7 Gyakori hibák a Giemsa színezésében
    • 7.1 Rendkívül kék színezés
    • 7.2 Túlságosan rózsaszín színezés
    • 7.3 A csapadékok jelenléte a kenetben
    • 7.4 Morfológiai leletek jelenléte
  • 8 Tárolási mód
  • 9 Referenciák

A Giemsa színezés alapja

A Romanowsky típusú festékek a sav és bázikus festékek közötti kontraszt használatán alapulnak, hogy a bázikus és savszerkezetek színezzék. Amint látható, a savas színezékek affinitása az alapszerkezetek festésére és fordítva.

Az alkalmazott alapfesték metilén-kék és oxidált származékai (Azure A és Azure B), míg a savas festék eozin..

A sejtek savas szerkezetei közé tartoznak többek között a szegmentált bazofilek szemcséi, így metilén-kék színezékkel..

Ebben az értelemben a sejtek bázikus szerkezetei hemoglobin és néhány granulátum, például a szegmentált eozinofilekben található granulátumok; ezeket eozinnal festjük.

Másrészt, mivel a metilén-kék és azúrkék metakromatikus színezékek jellemzik, változó hangot adhatnak a különböző struktúráknak a polianionok terhelésének megfelelően..

Így képes az alap- és savas színezékek stratégiai kombinációja az egyes struktúrák biokémiai jellemzőinek megfelelően széles színskálát kifejleszteni, savas struktúrák esetén sápadt, sötétkék, lila és lila árnyalatokon keresztül..

Míg az eozin által nyújtott színezés stabilabb, a színek vöröses-narancs és lazac között jönnek létre.

anyagok

Anyagok az anyaoldat elkészítéséhez

A törzsoldat elkészítéséhez 600 mg porított Giemsa festéket kell mérni, 500 ml acetonmentes metil-alkoholt és 50 ml semleges glicerint mérve..

Az anyaoldat elkészítési módja

Helyezze a nehéz Giemsa port egy mozsárba. Ha csomók vannak, ezeket permetezni kell. Ezután adjunk hozzá jelentős mennyiségű mért glicerint, és jól keverjük össze. A kapott keveréket egy nagyon tiszta borostyán üvegbe öntjük.

A glicerin többi részét a habarcsba helyezzük. Keverjük össze újra, hogy megtisztítsuk a maradék festéket, amely a habarcs falához ragadt, és öntsük ugyanabba a palackba.

A palackot lefedjük és 2 órán át 55 ° C-os vízfürdőben tartjuk. Bain-marie fürdőben, félóránként enyhén keverjük össze a keveréket.

Ezt követően az elegyet hagyjuk lehűlni, hogy az alkoholt elhelyezzük. Korábban a mért alkohol egy részét a habarcsba helyezik, hogy befejezze a festék mosását, majd a többi alkohollal együtt hozzáadjuk a keverékhez..

Ezt a készítményt legalább 2 hétig kell hagyni. Az anyalúgból felhasznált részt szűrni kell.

A készítmény szennyeződésének elkerülése érdekében ajánlatos átadni azt a részt, amely állandóan cseppentővel ellátott kis borostyán üvegbe kerül. Töltse fel minden alkalommal, amikor a reagens elfogy.

Anyagok a pufferoldat elkészítéséhez

Másrészt a pH = 7,2 pufferoldatot az alábbiak szerint állítjuk elő:

6,77 g (vízmentes) nátrium-foszfátot mérünk (NaHPO4), 2,59 g kálium-dihidrogén-foszfát (KH)2PO4) és desztillált víz 1000 cm3-ig.

A festék végső elkészítése

A végső festési oldat előállításához 2 cm3 szűrt törzsoldatot mérünk, és 6 cm3 pufferoldattal elegyítjük. Az elegyet keverjük.

Egy lényeges tény, amelyet figyelembe kell venni, az, hogy a festék előkészítésének technikái a kereskedelmi ház szerint változnak.

A színezés elvégzéséhez szükséges további anyagok

A leírt anyagokon kívül színes hidakkal, vízszűrőkkel vagy mosó pufferrel, tárgyak vagy burkolatok lapjaival, stopperrel, színezékszabályzókkal és blotpapírral vagy bizonyos szárazanyaggal használható anyaggal kell ellátni. géz vagy pamut).

technika

Festési folyamat

1) A színezés előtt a mintát tiszta lemezre kell helyezni..

A minták lehetnek vér, csontvelő, szövettani szövetek vagy cervico-vaginális minták. Javasoljuk, hogy a külső felületek vékonyak legyenek, és a színezés előtt 1 vagy 2 órát szárítsanak.

2) A színezendő lapok színes hídon helyezkednek el. Mindig ugyanabban a sorrendben dolgozzon és azonosítsa az egyes lapokat.

3) Helyezzen néhány csepp 100% -os metil-alkoholt (metanolt) a kenetre és hagyja 3-5 percig hagyni, hogy a mintát rögzítse és kiszárítsa..

4) A lapban lévő metanolt el kell dobni, és hagyja megszáradni.

5) Szárítás után helyezze a végső festőoldatot cseppentőbe, amíg a teljes lapot lefedik. Hagyjuk 15 percig hagyni. Egyes szerzők legfeljebb 25 percet javasolnak. A kereskedelmi háztól függ.

6) A festéket leöntjük és a kenetet desztillált vízzel vagy 7,2 pufferoldattal mossuk.

7) Blotpapíron hagyjuk, hogy a lapok szabadon, szárazon, függőlegesen, támaszték segítségével megszáradjanak.

8) Törölje le a csúszkát a maradék festék eltávolításához alkohollal megnedvesített gézzel vagy pamut tamponnal.

Rezsi

A Giemsa festési technikát számos területen alkalmazzák, többek között: hematológia, mikológia, bakteriológia, parazitológia, citológia és citogenetika.

hematológia

Ez a festés leggyakoribb segédprogramja. Ezzel azonosíthatjuk a csontvelő vagy a perifériás vér mintáiban jelenlévő összes sejtet. A leukocitózis vagy a leukopénia, a thrombocytopenia stb..

Mivel érzékeny az éretlen sejtek azonosítására, az akut vagy krónikus leukémiák diagnosztizálásakor fontos. Az anémia diagnosztizálása is lehetséges, mint például a sarlósejtes betegség, a sarlósejtes betegség..

mikológia

Ezen a területen gyakori, hogy használja a keresést Histoplasma capsulatum (intracelluláris dimorf fungus) szövetmintákban.

bakteriológia

A Giemsa-val festett hematológiai kenetben kimutatható Borrelias sp azoknál a betegeknél, akiknél a betegség láz recurrentis. A spirochetek bőségesek az eritrociták között, a lázas csúcson vett mintákban.

Lehetséges az intracelluláris baktériumok vizualizálása is Rickettsias sp és Chlamydia trachomatis fertőzött sejtekben.

parazitológiai

A parazitológia területén a Giemsa festés lehetővé tette a parazita betegségek, például a malária, a Chagas-betegség és a leishmaniasis diagnosztizálását..

Az első két parazita Plasmodium sp és a Trypanosoma cruzi illetve a fertőzött betegek perifériás vérében láthatóvá válnak, különböző szakaszokban találhatók a betegség fázisának megfelelően..

A vérparaziták keresésének javítása érdekében ajánlatos a May-Grünwald festékkel kevert Giemsa foltot használni.

Hasonlóképpen a Giemsa-val festett bőrbiopsziák mintáinak vizsgálatakor diagnosztizálható a bőr leishmaniasis, ahol a parazita megtalálható.

citológia

A Giemsa festést az endocervikális minták citológiai vizsgálatára is használják, bár ez nem a leggyakrabban használt technika erre a célra..

Az erőforrások szűkössége esetén azonban a Papanicolaou technika által kínált funkciókhoz hasonló funkciókkal és alacsonyabb költséggel is használható. Szükséges azonban a vizsgáztató szakértelme.

cytogenetika

A Giemsa festésének lényeges jellemzője, hogy képes erősen kötődni a DNS-adeninekben és timinokban gazdag régiókhoz. Ez lehetővé teszi a DNS megjelenését a sejtek mitózisa során, különböző kondenzációs állapotokban.

Ezek a vizsgálatok szükségesek a kromoszóma különböző területeinek kromatikus aberrációinak, például a másolatok, deléciók vagy transzlokációk kimutatásához..

Kutatás a Giemsa festés hatékonyságáról

Cannova és munkatársai (2016) 3 színező technikát hasonlítottak össze a bőr leishmaniasisának diagnosztizálására.

Ehhez kísérleti állatból vett mintákat használtak (Mesocrisetus auratus) kísérletesen beoltották Leishmaniával.

A szerzők kimutatták, hogy a Giemsa festés jobb volt, mint a Pap-mart® és Gaffney festés. Ezért úgy vélték, hogy a Giemsa festék ideális a bőr leishmaniasisának diagnosztizálására.

A szerzők által elért kiváló eredmények annak a ténynek köszönhetőek, hogy a Giemsa keveréket alkotó színezékek kombinációja a kedvező kontraszt létrehozásához szükséges feltételeket biztosítja, lehetővé téve az amastigote struktúrák egyértelmű és megkülönböztetését, mind az intracelluláris, mind az extracellulárisan..

A többi technika (Pap-mart® és Gaffney) is ezt tette, de gyengébb módon, és ennélfogva nehezebb volt látni. Ezért ajánlott a Giemsa folt a leishmaniasis parazitológiai diagnózisához.

Hasonlóképpen, Ramírez és munkatársai (1994) tanulmánya a Giemsa és a Lendrum foltok érvényességét a kötőhártya-kenetben értékelték. Chlamydia trachomatis.

A szerzők megállapították, hogy Giemsa és Ledrum festés ugyanolyan specifikus, de Giemsa érzékenyebb volt.

Ez magyarázza, miért jelenleg a Giemsa festés a leggyakrabban használt a chlamydialis fertőzések diagnosztizálásához, különösen, ha kevés erőforrás van.

Ajánlások a jó festéshez

A lemezek szárítását nem szabad gyorsítani. A prudenciális időt a szabadban való szárításra várni kell. Kb. 2 óra.

A legjobb eredmény érdekében azonnal 2 óra múlva színezzük.

Ahhoz, hogy a kenetet jobban rögzítsék és festékessé tegyék, a mintát úgy kell elosztani a lapon, hogy egy vékony és egyenletes réteg maradjon.

Az előnyös vérminta a kapilláris, mivel a kenet közvetlenül a vércseppből készül, és ezért a minta nem tartalmaz adalékanyagot, amely előnyben részesíti a sejtstruktúrák fenntartását..

Ha azonban vénás vért használnak, az EDTA-t antikoagulánsként és nem heparinnak kell használni, mivel ez utóbbi általában a sejteket deformálja.

Gyakori hibák a Giemsa színezésében

Ennek a színezésnek a gyakorlatában hibákat lehet tenni. Ezeket a struktúrák árnyalatainak hirtelen változásai bizonyítják.

Rendkívül kék szín

Ennek oka lehet:

  • Nagyon vastag kenet
  • A festési idő túllépése
  • Túl kevés mosás.
  • Reagensek alkalmazása semleges pH-n túl (lúgos).

Ilyen körülmények között a következő struktúrák színei torzulnak, hogy a halvány rózsaszín-lazac helyett az eritrociták zöldek legyenek, a festett vörös téglájú eozinofilek szemcséi kékre vagy szürkere kerülnek, és így tovább lesz eltérések a szokásos tónusokban.

Túlságosan rózsaszín szín

Ennek oka lehet:

  • Elégtelen festési idő.
  • Tartós vagy túlzott mosás.
  • Rossz szárítás.
  • Nagyon savas reagensek alkalmazása.

Ebben az esetben a normálisan festett szerkezetek nem lesznek szinte láthatóak, míg a rózsaszínre festett struktúrák nagyon eltúlzott tónusokkal rendelkeznek.

Példa: az eritrociták élénkvörös vagy erős narancssárga színűek lesznek, a nukleáris kromatin halvány rózsaszínű lesz, és az eozinofilek szemcséi ragyogóvá válnak..

Csapadékok jelenléte a kenetben

Az okok lehetnek:

  • Használjon piszkos vagy rosszul mosott lapokat.
  • Ne hagyja, hogy a kenet jól száradjon.
  • Hagyja túl sokáig a rögzítő oldatot.
  • Nem megfelelő mosás a festés végén.
  • A használt festék nem megfelelő szűrése vagy nem szűrése.

Morfológiai tárgyak jelenléte

Morfológiai tárgyak jelenhetnek meg a kenetben, ami megnehezíti a meglévő struktúrák megjelenítését és értelmezését. Ennek oka:

  • Az alkalmazott antikoaguláns típus, például a heparin.
  • Piszkos, sérült vagy zsíros lapok használata.

Tárolási mód

Az elkészítés után a festéket szobahőmérsékleten (15–25 ° C) kell tartani, hogy megakadályozza a festék kicsapódását. Zárt borostyán tartályban kell tárolni.

referenciák

  1. Cannova D, Brito E és Simons M. Színező technikák értékelése a bőr leishmaniasisának diagnosztizálására. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Applichem ITW reagensek. Giemsa folt. 2. verzió: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanyolország.
  3. Clark G. Staining eljárások (1981), 4th. Williams és Willkins.
  4. Alkalmazott klinikai kémia Giemsa festék a diagnózishoz in vitro. Forgalmazó: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F és Grazioso C. A Giemsa és Lendrum foltok érvényessége kötőhártya-kenetben Chlamydia trachomatis. Bol a Sanit Panam-tól. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. Általános Mycology. 1994. 2nd Ed. Universidad Central de Venezuela, Könyvtár kiadás. Venezuela, Caracas.
  7. - Giemsa folt. Wikipédia, A szabad enciklopédia. 2017. szeptember 1., 01:02 UTC. 2018. december 6., en.wikipedia.org.