Gramfolt alapok, anyagok, technika és felhasználás

az Gram folt A diagnosztikai mikrobiológia legegyszerűbb és leghasznosabb festési technikája. Ezt a technikát a dán orvos, Hans Christian Gram 1884-ben hozta létre, aki a sejtfal összetételének megfelelően sikerült besorolni a baktériumokat Gram-pozitív és Gram-negatív értékben..

A technika Hucker 1921-ben bizonyos módosításokat hajtott végre a reagensek stabilizálása és a folt minőségének javítása érdekében, így a Gram-festék Gram-Hucker néven is ismert..

Ezzel a módszerrel megfigyelhető a mikroorganizmusok formája is, azaz, hogy ezek kókuszok, bacillák, kokcobacillák, pleomorf, szálasak. Az űrben való eloszlása ​​mellett: klaszterben, láncban, izoláltan, párban, tetrádban stb..

Bakteriális fertőzés gyanúja esetén a beérkezett minták többségét egy dián kell elosztani, és a mikroszkóp alatt vizsgálni kell Grammal..

A Gram jelentése az orvosnak tájékoztatja, hogy a mikroorganizmus milyen típusú lehet a fertőzés oka, mielőtt a termés végeredményét megszerzi.

Bizonyos esetekben a beteg élete nagyon veszélyeztetett, így az orvosoknak sürgősen szükségük van a Gram-jelentésre, hogy empirikus kezelést nyújtsanak, miközben várják a mikroorganizmus azonosítását..

Például, ha a Gram kiderül, hogy a cerebrospinális folyadékban Gram-pozitív kókuszok vannak, az orvos a kezdeti terápiát az antibiotikumokkal, amelyek az ilyen típusú baktériumokat kiküszöbölik, az erre vonatkozó protokolloknak megfelelően..

Amint a végeredmény az elkülönített mikroorganizmus nevével és annak megfelelő antibiotikumával érkezik, az orvos megvizsgálja, hogy módosítsa-e a terápiát. Ezt a döntést a mikroorganizmus érzékenységének tanulmányozása alapján fogják meghozni, és azt, hogy a mikroorganizmus milyen antibiotikumokkal rendelkezik, és a beteg fejlődését..

index

• 1 Alapítvány
• 2 Anyagok
• 3 Festékek és reagensek készítése
  • 3.1 Kristály lila oldat
  • 3.2 Iodo-Lugol
  • 3.3 Fehérítés
  • 3.4 Kontraszt
• 4 A reagensek tárolása
• 5 A színezendő minta terjedésének előkészítése
  • 5.1 -A közvetlen minták grammja
  • 5.2. A növények grammja
• 6 Technika
• 7 Segédprogram
• 8 Gyakori hibák
• 9 Referenciák

alapítvány

Ez egy olyan módszer, amely 4 alapvető lépést tesz lehetővé: festés, rögzítés a szennyeződéssel, elszíneződés és összehúzódás. Ezért ez a technika a baktériumok színezésén túl megkülönbözteti őket.

A kristály ibolya az első színezőanyag. Affinitása van a peptidoglikánra és a lila színez minden baktériumot, majd elhelyezi a pisztolyt, ami káros hatású, vagyis oldhatatlan kristály violet-jód - ribonukleáris fehérjék képződését idézi elő a sejten belül.

Gram-pozitív baktériumok, amelyek peptidoglikán vastag falával rendelkeznek, több komplexet képeznek (kristály violet-jód), ezért megtartják a festéket.

Azt is befolyásolja, hogy a Gram-pozitív baktériumok fala nagyobb mennyiségű telítetlen savat tartalmaz, amely nagy affinitást mutat az oxidálószerekkel szemben (Lugol).

Eközben a Gram-negatív baktériumoknak vékony réteg peptidoglikánja van, ami a baktériumokat kevésbé bonyolítja, mint a Gram-pozitív baktériumok..

Ezután jön az elszíneződés lépése, ahol a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumok másképp viselkednek.

A gram-negatív baktériumok olyan külső membránt tartalmaznak, amely gazdag lipopoliszacharidokban, amely a sejtfal része. A zsírokat alkohol acetonnal érintkezve elpusztítják, így a külső membrán destabilizálódik, a lila kristály felszabadul.

Ily módon a színt a piros színnel szafraninnal vagy alapfukszinnal ellensúlyozzák.

Gram-pozitív baktériumok esetében ellenállnak az elszíneződésnek, mivel a fehérítő hatással van a pórusok bezárására, ami megakadályozza a kristály violet / jódkomplex kilépését.

Ezért az ibolyakristály színezése stabil, és nincs helye szafraninnak vagy fukszinnak. Emiatt ezek a baktériumok intenzív kék vagy lila foltokat festenek.

anyagok

A Gram színező készlet a következőket tartalmazza:

• Lila kristály
• Lugol
• Aceton-alkohol
• Safranin vagy alapvető fukszin

Festékek és reagensek készítése

Kristály lila oldat

A megoldás:

Lila kristály -2 gr

95% -20 ° C etil-alkohol

B megoldás:

Ammónium-oxalát -0,8 g

Desztillált víz-80 cm3

A lila kristály végső előállításához az 1:10 oldatot desztillált vízzel kell hígítani, és 4 rész B-oldattal elegyíteni. A keveréket felhasználás előtt 24 órán át tárolni kell. A szűrőt egy lombikban szűrjük, amint borostyánfestés történik egy papírszűrő segítségével.

A naponta felhasználandó mennyiség cseppentővel borostyán üvegbe kerül.

Jód-Lugol

Mérjük meg és mérjük meg az egyes vegyületek jelzett mennyiségét az alábbiak szerint:

Iodo kristályai - 1gr

Kálium-jodid - 2gr

Desztillált víz -300 cm3

A kálium-jodid kis mértékben feloldódik a vízben, majd hozzáadjuk a jódot. Az oldatot borostyánsárga színű palackba borítjuk.

A naponta felhasználandó mennyiséget cseppentővel egy kisebb borostyán üvegbe visszük át.

fehérítés

95% etil-alkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Ez egyenlő részekben készül. Fedjük le jól, hajlamos elpárologni.

Helyezzen egy üvegbe cseppentővel.

Ez a készítmény mérsékelt idővel 5-10 másodpercig változik, és a leginkább ajánlott.

A kezdők inkább 95% -os etil-alkoholt használnak, ahol az elszíneződés 10 és 30 másodperc között lassabb.

Míg a legtapasztaltabbak tiszta acetont használnak, ahol az elszíneződés nagyon gyorsan 1-5 másodpercig történik.

kontraszt

Safranin törzsoldat

Safranina -2,5 gr

Etil-alkohol 95% -100 cm3

A megadott mennyiségű safranint 100 ml etil-alkoholban oldjuk 95% -ra..

A működő szafranin oldatot az alapoldatból állítjuk elő.

Ehhez mérjünk fel 10 cm3 törzsoldatot, adjunk hozzá 90 cm3 desztillált vizet a 100 ml elkészítéséhez.

Javasoljuk, hogy a naponta használt mennyiséget cseppentővel töltse a borostyán üvegbe.

Gram-negatív Gram-Hucker foltokkal, például bizonyos anaerobokkal festett mikroorganizmusok, Legionella sp, Campylobacter sp és Brucella sp, sokkal jobban festhetők, ha a Kopeloff által a Gram-Hucker festéshez, a Gram-Kopeloff-féle festéshez készített módosítást alkalmazzuk.

Ez a technika megváltoztatja a safranin festéket alapfukszinnal. Ezzel a módosítással lehetséges a fent említett mikroorganizmusok hatékony színezése.

A reagensek tárolása

Az elkészített színezékeket szobahőmérsékleten kell tárolni.

A minta előkészítése színre terjedt

A mintának legalább 10⁵ mikroorganizmusok előfordulása előtt a mikroorganizmus megfigyelését valószínűsíti. A direkt mintákból vagy szilárd vagy folyékony közegekből lehet terjeszteni.

A terjesztéseknek egységesnek, jól elosztottnak és nem túl vastagnak kell lenniük a jelenlévő struktúrák jobb megjelenítéséhez.

-A közvetlen minták grammja

Vizelet gramm centrifuga nélkül

A vizeletet összekeverjük és 10 μl-t helyezünk egy csúszdára. A legalább egy baktérium / Immersion mező megfigyelése azt jelzi, hogy fertőzés van.

Ez azt jelenti, hogy a tenyészet körülbelül 100 000 CFU / ml-nél (10⁵ CFU / ml) az esetek 85% -ában.

Ez a módszer nem hasznos 100 000 CFU-nál alacsonyabb telepek számában.

LCR Gram

A CSF-et centrifugálni kell, a felülúszót eltávolítani kell, és a pelletet egy csúszdán el kell helyezni. Ez a folyadék normál körülmények között steril; a baktériumok megfigyelése fertőzést jelez.

Gramm légzési minták

A Gram, a hörgő vagy a bronchoalveoláris öblítés, bár sokféle mikroorganizmus létezik, mindig a diagnózisban fog vezetni, ráadásul hasznos a megfigyelt sejtek típusa is..

A köpet esetében a kenetet a minta legtisztább részével kell elkészíteni.

Stool Gram

Nem ajánlott Gram-ot végrehajtani az ilyen típusú mintákra, mivel nincs diagnosztikai értéke.

-Gramos növények

Ezeket kétféleképpen lehet elvégezni: az egyik a folyékony növényekből, a másik a szilárd növényekből.

Folyékony növények

A folyékony tenyészetekből rendkívül egyszerű; az öngyújtó alatt a zavaros tápközeg több pörköltjét veszik fel, és egy tiszta és száraz csúszdára helyezik, amely körkörös mozdulatokat tesz lehetővé a központtól a periféria felé, hogy az anyagot egyenletesen terjesszék.

Megengedhető, hogy spontán megszáradjon a levegőben. Szárítás után az anyagot hőre rögzítik. Ehhez egy 3 szorító segítségével a 3 lapot a Bunsen-égő lángján 4-szer áthúzzuk, ügyelve arra, hogy az anyagot ne égesse el..

A lapot hagyjuk lehűlni és a színhídra helyezni.

Szilárd növények

A Gram-foltok szilárd kultúrából történő kiterjesztésének végrehajtásához tegye a következőket:

Mielőtt kiválasztanánk a befogadandó telepeket, elő kell készíteni a csúszkát, két csepp hozzávetőlegesen steril fiziológiás sóoldatot.

Ha az eredeti tenyésztőlemez többféle kolóniát tartalmaz, akkor mindegyikből izolált kolónia kerül kiválasztásra a Gram végrehajtására. Mindegyik kolóniát a platina hurokkal fogjuk fel, hogy feloldjuk azt a sóoldatban előzetesen elhelyezett sóoldatban.

A középponttól a perifériához körkörös mozdulatokat adunk, hogy a kolónia homogénen eloszlik a diara..

Megengedhető, hogy spontán megszáradjon a levegőben. Szárítás után a lapot hővel rögzítjük, a fentiekben leírtak szerint (a csúszka lángja az öngyújtóval), ügyelve arra, hogy ne égesse az anyagot.

Ezt az eljárást minden egyes kolóniával kell elvégezni. Egy papírlapon meg kell jegyezni a megfigyelt sorrendet, például:

1. kolónia: Sárga béta-hemolitikus kolónia: Gram-pozitív kokszokat figyeltünk meg klaszterekben

2. kolónia: krém kolónia, hemolízis nélkül: Gram-negatív kokcobacillákat figyeltünk meg.

Minden lapot fel kell címkézni, hogy tudjuk, mit figyelünk.

technika

A Gram festési technika rendkívül egyszerű és viszonylag olcsó, és nem hagyható ki egy mikrobiológiai laboratóriumban.

Ugyanez történik a következőképpen:

1. Rögzítse a kenetet hővel és helyezze a színes hídon.
2. A lapot 1 percig teljesen lila üveggel fedjük le.
3. Mossuk le vízzel. Ne száradjon
4. Fedjük le a lemezt Lugol-oldattal, hagyjuk 1 percig. Mossuk le vízzel. Ne száradjon.
5. A keveréket 5-10 másodpercig keverjük, enyhe keverés közben aceton-alkoholban. Vagy tegye a lapot függőleges helyzetbe, és cseppentesse a cseppentőszert a felületre, amíg a megmaradt lila üveg el nem húzódik. Ne lépje túl.
6. Mossuk le vízzel. Ne száradjon.
7. Helyezze vissza a lapot a színes hídra, és fedezze 30 másodpercig safraninnal (Gram-Hucker) vagy 1 perccel alapfukszinnal (Gram-Kopeloff)..
8. Mossuk le vízzel
9. Hagyja, hogy függőleges levegőben spontán száradjon.

Szárítás után helyezzünk egy csepp merülőolajat, hogy az optikai mikroszkópban 100X-os célt vegyük figyelembe.

hasznosság

Ez a technika lehetővé teszi, hogy megkülönböztessük a legtöbb baktérium morfotípusos különbségeit.

Az élesztők is ezt a színt különböztetik meg. Elveszik a kristály ibolyát, azaz Gram-pozitívak.

Másrészt megkülönböztethetőek a Gram-pozitív spóraképző bacillák, amelyekben a bacilluson belül tiszta tér van, ahol az endospórus kialakult, bár a spórák nem foltosak jól. A spórák használatához más technikákat, például a Shaeffer-Fultont használnak.

Meg kell jegyezni, hogy ez a folt nem szolgál minden típusú baktérium színezésére, vagyis vannak olyan esetek, amikor a festés nem működik.

Ebben az esetben említhetők a sejtfal hiányzó baktériumok. Például: Mycoplasma nemzetség, szferoplasztok, Ureaplasma, L-formák és protoplasztok.

Szintén rosszul baktériumok, amelyek mikolsavakban gazdag falakkal rendelkeznek, mint például a Mycobacteriumok és az intracelluláris baktériumok, mint például a Chlamydias és a Rickettsias..

A legtöbb spirochetális baktérium foltja is nem hatékony.

Vannak ugyanazon nemzetségbe tartozó baktériumok, amelyek ugyanabban a mintában megfigyelhetők, mint a Gram-pozitív és a Gram-negatív. Ha ez megtörténik, akkor változó Gram-foltnak nevezzük, amely a tápanyagok, a hőmérséklet, a pH-érték vagy az elektrolitkoncentráció változásából adódik..

Gyakori hibák

Túlzottan fehérítse

Az elszíneződési lépésben való túlzás a hamis gram-negatív mikroorganizmusok megfigyelését okozhatja.

Ne várjon elegendő száradási időt a merülő olaj hozzáadásához:

Ez a hiba zsíros micellák kialakulását okozza, amelyek megnehezítik a jelenlévő struktúrák megfigyelését. Ez akkor történik, amikor az olaj csatlakozik a kenetben lévő vízmolekulákhoz.

Fordítsa vissza a reagensek sorrendjét:

Egy ilyen hiba miatt a Gram-negatív baktériumok lila, azaz hamis Gram-pozitívak lesznek.

Használjon régi növényeket (szilárd vagy folyékony):

Gram-pozitív baktériumokat okozhat Gram-negatívnak (hamis Gram-negatív). Ez azért van, mert a régi kultúrákban valószínű, hogy halott vagy romlott baktériumok vannak, és ezekben a körülmények között a baktériumok nem tartják meg a lila kristályt.

Használjon nagyon régi Lugol-oldatot:

Idővel elveszíti tulajdonságait és a színe elhalványul. Ha a már degenerált reagenst használjuk, akkor nem fogja jól megkötni a kristály violetet, ezért lehetőség van a mikroorganizmusok vizuális megjelenítésére..

Kék háttér

A megfelelően elszíneződött háttér piros lesz. A kék háttér azt jelzi, hogy az elszíneződés elégtelen.

referenciák

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. mikrobiológia Orvosi, 6. kiadás McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. (5. kiadás). Argentína, szerkesztő Panamericana S.A..
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiológiai diagnózisa. 12 ed. Argentínában. Panamericana S.A szerkesztő
4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. 2. kiadás Universidad Central de Venezuela, Könyvtár kiadások. Venezuela, Caracas.
5. "Gram folt" Wikipédia, A szabad enciklopédia. Okt. 4, 2018, 23:40 UTC. 2018. december 9., 17:11. Készült az es.wikipedia.org oldalról.
6. González M, González N. 2011. Orvosi mikrobiológiai kézikönyv. 2. kiadás, Venezuela: A Carabobo Egyetem média- és kiadványigazgatósága.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Alapvető festés a mikrobiológiai laboratóriumban. A fogyatékossággal kapcsolatos kutatás. 2014 3 (1): 10-18.